Abstract We report the alterations of immunological parameters of a patient with visceral leishmaniasis caused by Leishmania (Leishmania) infantum from the Northwest of Argentina during active disease and after achieving clinical recovery. We first demonstrated elevated amounts of IFN-γ, IL-10, B-cell activating factor (BAFF) and IgG in plasma during active disease, which returned to control values after recovery. In relation to T cell profile, we measured CD27, CD28, CD45RO, CD57 and perforin. We found a highly differentiated phenotype, preferentially in active disease and among CD8+ T cells, consisting in increased numbers of late differentiated and terminal effector cells. Although this highly differentiated CD8+ T cell phenotype persisted after recovery, a clear increase of central memory cells was recorded for both T subsets at that point, suggesting signs of reversion toward a less differentiated profile. The composition of the B cell compartment was slightly modified during active disease. Herein wedocument the global impact of severe visceral leishmaniasis on immunological parameters, which tend to revert upon clinical recovery, suggesting signs of immune restoration accompanying clinical improvement. The evaluated parameters could eventually be used as biomarkers of clinical evolution of visceral leishmaniasis.

Resumen En el presente trabajo informamos la afectación de parámetros inmunológicos durante la etapa grave de la infección y luego de alcanzar la recuperación clínica en un paciente autóctono del Noroeste argentino con leishmaniasis visceral causada por Leishmania (Leishmania) infantum. Detectamos concentraciones plasmáticas elevadas de interferón-γ, interleuquina 10, IgG y BAFF (B-cell activating factor) durante la enfermedad activa, que se normalizaron luego de la recuperación clínica. En relación al perfil de diferenciación y memoria de las células T, clasificamos las células según la expresión de CD27, CD28, CD45RO, CD57 y perforina. Encontramos un fenotipo altamente diferenciado analizando la población de linfocitos T CD8+, con porcentajes aumentados de células T de diferenciación tardía y efectoras terminales. Si bien el fenotipo T CD8+ persistió luego de la recuperación clínica, pudimos observar un claro aumento de células T de memoria central en ese punto de estudio, sugiriendo signos de una posible reversión hacia un perfil T menos avanzado. El compartimiento de células B CD19+ mostró cambios más leves en la composición de las subpoblaciones de memoria. Documentamos el compromiso global de parámetros inmunológicos en la etapa grave de la leishmaniasis visceral que tienden a revertir luego de la recuperación, sugiriendo posibles signos de reconstitución inmune acompañando a la mejoría clínica. Los parámetros evaluados podrían ser útiles como biomarcadores de la evolución clínica de la enfermedad.

The detection of specific nucleic acid (NA) sequences by PCR has revolutionized the biological and medical sciences. Real-time PCR (qPCR) opened up the possibility of obtaining quantitative results. NA extraction is a decisive step prior to qPCR since it may produce either the removal or co-extraction of inhibitory substances of the enzymatic reaction, which in turn affects the amplification efficiency. In the present work we compared the commercial NA extraction kits from Qiagen, Invitrogen and Macherey-Nagel, which were used to extract DNA from mice blood artificially infected with Trypanosoma cruzi and PP7 RNA, Pseudomonas aeruginosa bacteriophage, in spiked aqueous matrices. NA recovery efficiency in samples without inhibitors was similar for the three extraction kits. However, the Invitrogen kit was the only one that remained unaffected in the presence of inhibitors in the samples.

La detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos (AN) empleando PCR revolucionó las ciencias biológicas y médicas. La PCR en tiempo real (qPCR) incorporó la posibilidad de obtener resultados cuantitativos. Una etapa decisiva previa a la qPCR es la extracción de AN, en la que se pueden producir tanto la remoción como la extracción conjunta de sustancias inhibidoras de la reacción enzimática, lo que afectará la eficiencia de amplificación. En el presente trabajo se realizó una comparación entre los kits de extracción comerciales Qiagen, Invitrogen y Macherey-Nagel, utilizados para extraer ADN de Trypanosoma cruzi de sangre murina artificialmente infectada y ARN de PP7, bacteriófago de Pseudomonas aeruginosa, sembrado en matrices acuosas, en presencia o ausencia de inhibidores. La eficiencia de recuperación de AN en muestras sin inhibidores fue similar para los tres kits de extracción. El kit de Invitrogen fue el único que no se vio afectado por la presencia de inhibidores en las muestras.

It is important to know whether the variability of species of Leishmania parasites circulating in a region affects the performance of the ELISA test for the diagnosis of leishmaniasis. Therefore, the aim of this study was to analyze the reactivity of the ELISA using homogenates of promastigotes of Leishmania (V.) braziliensis (ELISAb), Leishmania (L) amazonensis (ELISAa) and Leishmania (V.) guyanensis (ELISAg) against different sera groups. Samples from individuals with cutaneous leishmaniasis (n = 37), mucocutaneous leishmaniasis (n = 8), healthy controls (n = 52), persons infected with Trypanosoma cruzi (n = 11) and mixed infections (n = 14) were included in the study. We calculated sensitivities, specificities, cut offs, and predictive values for the three tests and compared them using ANOVA, kappa index, ROC curves comparison, and confidence intervals calculated by the bootstrap method. Significant differences were found when comparing the OD levels of sera from patients with cutaneous leishmaniasis against healthy controls, but there were no differences when comparing the different ELISAs. The sensitivities calculated for ELISAb and ELISAa were 84.6 and of 88.5% for ELISAg, while the value of specificity for the three tests was 96.2. The kappa index (0.87) and comparison of ROC curves showed similar performance for the three ELISAs (p = 0.225). The high reactivity obtained for these ELISAs in sera of patients with mucocutaneous leishmaniasis indicates this test as an important complement in the diagnosis of the disease.

Es importante conocer si la variabilidad de especies de Leishmania circulantes en una región afecta la performance de las pruebas de ELISA estandarizadas para el diagnostico de la leishmaniasis. El objetivo de este trabajo fue analizar la reactividad de la prueba de ELISA utilizando homogenados de promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis (ELISAb), L (L) amazonensis (ELISAa) y L (V.) guyanensis (ELISAg) frente a distintos grupos de sueros. Se estudiaron muestras de personas con leishmaniasis cutánea (n = 37), leishmaniasis mucocutánea (n = 8), no infectados (n = 52), infectadas por Trypanosoma cruzi (n = 11) e infecciones mixtas (n = 14). Se calcularon las sensibilidades, especificidades, cut off, valores predictivos, y se compararon las tres pruebas usando ANOVA, índice de concordancia kappa, comparación de curvas ROC e intervalos de confianza construidos por el método de bootstrap. Se encontraron diferencias significativas al comparar los niveles de DO de los sueros de pacientes con leishmaniasis cutánea respecto a los controles negativos, pero no se encontraron diferencias entre pruebas. Las sensibilidades calculadas fueron de 84.6% para ELISAb y ELISAa y de 88.5 para ELISAg, mientras que el valor de especificidad para las tres pruebas fue de 96.2. El índice de concordancia kappa y la comparación de curvas ROC mostraron performances similares para las tres pruebas (p = 0.225). La elevada reactividad obtenida para estas ELISAs frente a sueros de pacientes con leishmaniasis mucocutánea indica un importante potencial de esta técnica como complemento en el diagnóstico de la enfermedad.